La Galleria Borghese è il solo museo al mondo ad offrire un deposito concepito come una vera quadreria. Nel 2005, grazie al generoso contributo di Credit Suisse, al terzo piano della palazzina è stata allestita una “seconda pinacoteca”, uno spazio luminoso e organizzato aperto regolarmente al pubblico, ordinato per scuole di pittura e per aree tematiche, completo di tutti gli apparati espositivi. Qui si conserva quella parte della collezione che non trova posto nei due piani sottostanti, che la revisione strutturale e decorativa del tardo Settecento ha modificato rispetto all’assetto voluto dal Cardinale Borghese e che non consente più di esporvi l’intero catalogo delle opere.


Nel vano centrale si trova La Deposizione di Cristo nel sepolcro di Passignano, al piano superiore il Cristo flagellato di Giovanni Baglione, il biografo del Caravaggio. Nelle teche sono custoditi dipinti di più piccole dimensioni: tra questi emerge una raccolta notevole per specificità e qualità, costituita dagli splendidi olii su pietra paesina di Antonio Tempesta, La presa di Gerusalemme e Paesaggio fantastico, commessi in pietre dure di scuola fiorentina, preziosi paesaggi su rame, su alabastro, specifici del gusto collezionistico dell'epoca.

Nel grande ambiente dei depositi sono esposti, su due livelli, circa 260 dipinti. Nel corridoio esterno si trovano grandi tele di ambito raffaellesco, tra le quali la splendida Madonna con Bambino di Scipione Pulzone, la Madonna con Bambino di Perin del Vaga, la copia della celebre Madonna di Casa d'Alba della National Gallery di Washington.

Lungo le pareti del salone centrale, dedicate al Cinquecento e al Seicento, sono esposte, tra le altre, la Venere dormiente di Girolamo Pennacchi; il Cristo portacroce, maestoso dipinto storicamente attribuito a Sebastiano del Piombo ma il cui recente restauro ha permesso la nuova attribuzione a Giovanni De Vecchi; Giuseppe spiega i sogni e San Rocco di Giovan Francesco Guerrieri, , probabilmente appartenenti al periodo nel quale l’artista era attivo nella decorazione del Palazzo Borghese in Campo Marzio; alcune tele dei Carracci e Le Tre età dell'uomo, copia da Tiziano di Sassoferrato.